Flow Cytometric Minimal Residual Disease Assessment in Acute Lymphoblastic Leukemia

성균관의대 삼성서울병원 조 덕

목적 : 급성림프모구백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)의 최소잔존질환 (minimal residual disease, MRD) 검출에 사용되고 있는 각종 검사법의 장단점을 알고, 이중 유세포분석법에 의한 MRD 검출의 특징을 이해한다.

서 론

형태학적 골수판독은 급성백혈병 치료 효과판정에 필수적이나, 이들 방법만으로는 백혈병세포와 정상 조혈계전구세포를 완벽하게 판별할 수 없다. 형태학적 판독으로 아세포가 5% 미만이면 완전관해로 판정하고 있지만, 일부 환자는 백혈병세포가 잔존해 있을 가능성이 있다. 그렇다고 불필요하게 강화치료를 실시하면 항암치료의 독성에 의한 부작용이 발생할 수 있으므로, 정확하게 잔존하는 백혈병세포를 측정하는 것이 최적의 치료를 위해 중요하다.

이상적인 MRD 검출법의 조건

이는 10^-4 이상의 민감도를 갖고, 대부분 환자에게 적용가능하고, 빠르고, 정확해야 한다. 최근 van Dongen 등이 정리한 MRD 검출을 위한 대표적인 3가지 방법들의 특징은 아래 표에 정리되어 있다.

(Van Dongen et al. Blood. 2015;125(26):3996-4009)

이중 유세포분석법은 다른 두 방법에 비해 민감도가 다소 낮은 것으로 알려져 있지만, 표준화된 프로토콜로 전문가에 의해 검사가 이루어질 경우 10^-4 의 민감도를 유지할 수 있다.

유세포분석법에 의한 MRD 검출의 임상적 의의

소아 ALL 환자군에서 관해 후 검출되는 MRD 수준이 강력하면서도 독립적인 예후인자로 알려져 있다.

(Borowitz et al. Blood, 2008;111:5477-85)

최근에도 Borowitz 등이 Children’s Oncology Group (COG) study AALL0232로 치료한 고위험군 B-ALL 환자군에서 유세포분석법에 의한 MRD 검출이 가장 중요한 예후인자 중 하나였음을 확인하였다.

(Borowitz et al Blood. 2015;126(8):964-971)

유세포분석법에 의한 MRD 검출 시 고려할 점

정확한 MRD 검출을 위해서는 골수나 말초혈액에서 최소 10,000 세포당 1개의 백혈병세포를 검출할 수 있어야 하므로, 프로토콜에 따라 5 x 10⁶ 개 이상의 세포 분석을 요구하기도 하고, 750,000 ~ 1x10⁶ 세포의 분석을 추천하기도 한다. 형광은 기존의 4 개 color를 사용한 분석에서, 최근 6~8 color 이상을 사용하여 보다 높은 민감도를 확보할 수 있다. 이를 위해서는 정상세포와 감별되는 백혈병 고유의 표현형이 파악되어야 한다. 이를 leukemia associated immunophenotypes (LAIP)이라고 하는데, B lymphoblastic leukemia (BLL)에서 사용되는 LAIP의 발현 유형 4가지는 다음과 같다. 1) Overexpressed type; 백혈병세포는 정상세포보다 CD34, CD58, CD10, CD123을 높게 발현됨을 활용하여 MRD 검출에 활용한다. 2) Underexpressed type; 백혈병세포는 정상세포보다 CD45, CD38, CD24를 낮게 발현함을 활용하여 MRD 검출에 활용한다. 3) Asynchroneous type; 백혈병세포가 비정상적인 성숙과정을 보일 수 있는데, CD21+/CD10+ 세포나 CD20-/CD10- 세포는 정상 세포에는 드물기 때문에 백혈병세포로 간주할 수 있어 MRD 검출에 활용한다. 4) Crosslineage type; 소위 ectopic marker라고 하는 표지자가 발현하는 것인데, myeloid cell 표지자인 CD13, CD15, CD33이나 T cell 표지자인 CD2, CD4, CD5가 B-ALL에서 보인 경우 이들 세포는 백혈병세포로 간주할 수 있다. 이들 표지자를 활용하여 정상과 백혈병세포를 감별하는데, 치료 과정 중 표지자의 발현 정도가 변하는 경우도 자주 있으므로 주의해야 한다. B-ALL 환자군에서 고용량 스테로이드 치료시 CD34와 CD10 발현이 감소하는 것은 널리 알려진 사실이다. 또한, 치료 후 시기에 따라, 특히 21일 부근에 많이 존재하는 hematogones (regenerating B cell precursors)과도 정확히 감별해야 한다.

대표적인 유세포 MRD 프로토콜

유세포 MRD 검출에 널리 알려진 프로토콜에는 Dr Campana 팀 방법과 Dr Wood & Dr Borowitz 팀이 주도하여 Children's Oncology Group (COG)에서 사용하고 있는 방법이 있으며, Euroflow 팀에서 준비하는 프로토콜도 있다.

1) Dr Campana 팀이 제시한 항체종류와 color (KJH. 2012;47(4):245-54)

Using the markers listed in this table, a leukemia-associated signature can be identified in virtually all cases of B-lineage ALL at diagnosis. For the few remaining cases, additional markers that can be tested include CD133, CD15, anti-NG2, CD164, CD304, CD97, CD102, CD99, and CD300a.

2) Dr Wood & Dr Borowitz 팀이 개발한 Children's Oncology Group (COG) Protocol (치료 후 29일 골수 검체로 시행)

결 론

유세포분석법은 최근 multi-color를 사용하면서 10^-4 의 민감도와 높은 특이도를 보일 뿐 아니라 신속하고 정확하게 MRD 검출할 수 있어 그 임상적 유용성이 많은 연구에서 증명되었다. 하지만, 국내 의료기관에서는 유세포분석법에 의한 MRD 분석이 국제적 수준으로 아직 표준화되어 있지 않은 실정이다. 이를 극복하기 위해 보험급여 확대와 함께 국내 표준 프로토콜을 정립하여야 할 것으로 사료된다.

참고문헌

1. van Dongen JJ, van der Velden VH, Bruggemann M, Orfao A. Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood. 2015;125(26):3996-4009
2. Borowitz MJ, Wood BL, Devidas M, Loh ML, Raetz EA, Salzer WL, et al. Prognostic significance of minimal residual disease in high risk B-ALL: a report from Children's Oncology Group study AALL0232. Blood. 2015;126(8):964-71.
3. Gaipa G, Basso G, Biondi A, Campana D. Detection of minimal residual disease in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Cytometry B Clin Cytom. 2013 ;84(6):359-69.
4. Campana D, Coustan-Smith E. Measurements of treatment response in childhood acute leukemia. Korean J Hematol. 47(4):245-54.
5. Borowitz MJ, Devidas M, Hunger SP, Bowman WP, Carroll AJ, Carroll WL, et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a Children's Oncology Group study.Blood. 2008;111(12):5477-85.
6. Cho YU, Park CJ, Cha CH, Chi HS, Jang S, Kim MJ, et al. Minimal residual disease detection in acute leukemia patients by flow cytometric assay of cross-lineage antigen expression. Korean J Lab Med. 2010;30(6):533-9
7. Fossat C, Roussel M, Arnoux I, Asnafi V, Brouzes C, Garnache-Ottou F, et al. Methodological aspects of minimal residual disease assessment by flow cytometry in acute lymphoblastic leukemia: A French multicenter study. Cytometry B Clin Cytom. 2015;88(1):21-9.