응고검사는 수술 전 선별검사, 출혈성질환 및 혈전성질환의 원인을 찾거나, 또는 항응고제 치료 모니터링 등의 목적으로 널리 시행되는데, 특히 응고인자와 응고억제인자 검사는 채혈에서부터 결과보고에 이르기까지 많은 요인에 의해 영향을 받는다. 이번호에서는 특히 응고인자(coagulation factor)와 응고억제인자(anticoagulant factor) 검사 지침에 대해서 정리하였습니다.
응고검사는 특히 검사 전에 검체의 채혈, 조작 및 보관 과정이 검사결과에 밀접한 영향을 주기 때문에 아래와 같은 지침에 따라야 한다.
(1) 검체 채혈
2008년 CLSI 지침에 의하면 진공채혈관과 syringe 모두 채혈 가능하다. 바늘의 크기가 21게이지가 좋으면 이보다 적으면 용혈이나 혈소판활성의 문제가 발생할 수 있고, 19게이지보다 크면 혈관손상의 우려가 있어, 21-19 게이지 (소아 23) 바늘로 채혈하도록 한다. 항응고제는 혈장에 가까운 osmolality를 가지면서, 헤마토크릿에 따른 영향을 적게 받는 3.2% sodium citrate를 사용하고 혈액과 항응고제 비율 9:1을 지킨다. 채혈직후 채혈관을 5~6회 아래-위로 부드럽게 혼합한다. 다른 응고검사와 마찬가지로 헤마토크릿이 55% 이상이면 혈장부피가 상대적으로 적어 항응고제의 양을 다음과 같은 공식에 따라 줄여주어야 한다 [(항응고제 부피, ml)=(1.85 x 10-3)x(100-헤마토크릿,%)x(채혈할 혈액 양, ml)].
(2) 검체 수송 및 원침
검체는 실온에서 채혈 후 빠르게(1시간이내 이상적임) 운반한다. 응고검사용 혈소판 결핍 혈장(PPP)은 18~25°C에서 2000 g로 최소10분간 원침하지만, 검사실마다 원심분리 속도와 시간을 적절히 조절하여 PPP의 혈소판 수가 10,000/μL 이하가 되도록 설정하면 된다. 응괴가 있거나 용혈이 있으면 검체를 거절한다.
(3) 검체보관 및 준비
응고검사는 채혈 후 4시간이내 검사해야 한다. 4시간내 응고검사를 검사할 수 없는 경우는 혈장을 분리하여 -20°C에서 2주, -70°C에서 12개월까지 냉동보관할 수 있다. 얼린 검체를 녹일 때는 37°C에서 흔들면서 신속히 녹이고, 녹인 즉시 검사한다.
(4) 참고범위
정상성인 (약 120명, 최소 30명)에서 참고치를 산정하고, 소아 참고치는 따로 구한다. 이때 정규분포를 하면 평균 ±2표준편차로 산정하고 정규분포를 하지 않으면 로그로 전환하거나 2.5~97.5 percentile로 구한다.
특정응고인자를 결핍시킨 혈장 (specific factor deficient plasma)을 시약으로 사용하여 검사할 혈장과 일정비율로 희석하여 PT 또는 aPTT로 측정한다. 이때 PT와 aPTT 시약은 lupus anticoagulant에 민감하지 않은 것이 좋다. specific factor deficient plasma는 특정응고인자의 농도가 1 U/dL미만이면서 나머지 응고인자들의 농도는 정상수준이어야 한다.
응고인자 검사시에 검사할 혈장은 적어도 세가지 이상의 희석배수에서 검사를 진행하며 각 희석배수에서의 응고시간을 표준혈장(reference plasma)의 희석배수의 응고시간과 함께 도표에 그려서 평행(parallelism) 여부를 확인해야 한다. 표준혈장과 검사할 혈장의 직선이 서로 평행하지 않으면 lupus anticoagulant나 기타 억제인자가 존재하거나 항응고제 혼입, 검사할 혈장의 활성화 등의 가능한 원인을 찾아야 한다. 특정 장비에서는 직선성 (linearity)을 자동적으로 계산해주는데, 상관계수 (correlation coefficient, r)가 0.998~1.000에서 벗어나면 시약의 변성이나 오염, pH 변화 등을 체크해야 한다. 또 회귀분석을 하여 slope ratio (calibrator slope/test sample slope)이 0.9~1.1을 벗어나면, 억제인자 존재나 검사혈장의 활성화 가능성을 시사하는 소견으로 본다. 이때 calibrator line은 이전에 장비에 저장되었던 것을 사용하면 안되고 검사혈장과 함께 측정한 것을 사용하도록 한다. Calibration line은 10~150 U/dL이상에 걸쳐 포함되도록 하며, 응고인자의 농도가 높을 때는 검체를 희석을 하고, 낮은 경우는 낮은 농도를 커버할 수 있도록 다른 표준곡선을 설정하여 측정하도록 한다. 검사시에는 두가지 농도 (정상, 낮은 농도)의 정도관리 물질을 함께 측정해야 하며 외부정도관리 프로그램에 참여하도록 한다.
(2) Amidolytic assay of factor VIII:C
Factor VIII:C (활성도) 검사는 보편적으로 one-stage coagulation assay로 검사하지만, one-stage coagulation assay로 정상수준일 수 있는 mild & moderate hemophilia A를 더 민감하게 검사하기 위해 amidolytic assay를 사용할 수 있다. 다시 말해약 10% 정도의 mild & moderate hemophilia A에서 one-stage coagulation assay로 정상이지만 amidolytic assay에서 감소된 결과를 보이고 이 결과는 임상적 출혈양상과 비교적 일치한다고 한다. 또한 factor VIII concentrate 치료시 amidolytic assay 결과가 치료효과를 잘 반영한다는 보고가 있다.
선천성 혈전증의 선별검사로 antithrombin activity 검사를 시행하는 것이 좋으며, functional assay 중에는 amidolytic assay가 간단하고 정확하여 권장된다. 검사할 혈장을 thrombin 또는 factor Xa와 헤파린과 반응시킨 후 thrombin 또는 factor Xa에 대한 기질 (amidolytic substrate)를 사용하여 반응 후 남아있는 thrombin 또는 factor Xa의 활성도를 측정한다. Type I은 antithrombin activity와 antigen이 모두 감소하고, type II는 antithrombin activity 감소하나 antigen은 정상인 경우이다. 일단 antithrombin deficiency 의심되면 type II heparin-binding site defect와 type I을 감별하기 위해 antithrombin antigen assay를 ELISA, RID 등으로 시행할 수 있다.
(2) Protein C
선천성 혈전증의 선별검사로 protein C activity 검사를 amidolytic assay로 시행하는 것이 권장된다. 왜냐하면 응고법은 활성화된 protein C에 protein C 결핍혈장, 칼슘 및 인지질을 첨가하여 응고시간을 측정하는 원리로서, 응고인자 VIII 증가, 활성 C 단백저항성, lupus anticoagulant 양성일 때 protein C 활성도가 낮게 측정될 수 있기 때문이다. Amidolytic assay는 검사하려는 혈장에 뱀 독으로부터 분리한 활성물질(Protac)을 첨가하여 혈장 내 protein C를 활성화시키고, 이렇게 활성화된 protein C를 색소기질을 이용하여 발색반응으로 측정한다. 그러나 와파린 복용환자에서 amidolytic assay로 측정된 protein C의 활성도가 높게 측정될 수 있으므로 주의를 요한다. Protein C antigen 검사는 type I (activity와 antigen 모두 감소)와 type II (activity만 감소) 감별할때 필요하며 protein C activity가 정상범위일 때 type II deficiency carrier를 검출하는데 도움이 된다. Protein C는 비타민 K 의존 단백이므로 와파린(warfarin) 복용환자에서는 감소하므로 와파린 복용하지 않은 상태에서 측정해야 하며, 나이에 따른 차이가 있으므로 판단시 주의를 요한다.
(3) Protein S
Protein S는 protein C 의 보조인자로서, 혈장에 두 가지 형태로 존재하는데 약 60-70%는 C4b-binding protein과 결합된 비활성 형태로 순환하며, 나머지 40%는 유리형(free form)으로 존재하는데 유리형은 protein S의 활성화된 형태이다. Protein S 항원 검사는 전체 protein S(total protein S)와 유리형을 각각 측정할 수 있는데, 유리형 측정이 선별검사로 권장된다. Free protein S antigen 검사는 free protein S에 특이한 항체가 개발되어 ELISA로 측정이 가능하다. Rheumatoid factor나 anti-mouse antibody가 있으면 free protein S가 높게 측정될 수 있다. 최근에는 latex-based immunoturbidity로 free protein S를 측정할 수 있고 ELISA와 결과가 비슷하고 비교적 정확하며 검사시간이 짧고 자동화가 가능하다. Protein S activity를 응고법으로 측정할 수 있는데 이때는 factor V Leiden이나 lupus anticoagulant에 의해서 영향 받을 수 있고, 검사 kit에 따른 결과값의 차이가 커서 유럽에서는 혈전증 선별검사로 권장하지 않고 있다. Type I (total protein S antigen, free protein S antigen, protein S activity 모두 감소), Type II (protein S activity만 감소), type III (total protein S antigen 정상, free protein S antigen감소, protein S activity 감소)를 구분하는데 상기 검사들이 사용된다. Protein S는 신생아, 간질환, 와파린 복용환자, 임신, 피임약복용 때 감소하므로 해석시 주의를 요한다. 또한 남자보다 폐경전 여자에서 protein S가 의미 있게 낮다.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Collection, transport, and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays and molecular hemostasis assays; Approved Guideline-Fifth Edition. H21-A5. CLSI, Wayne, PA, 2008.
Mackie I, Cooper P, Lawrie A, Kitchen S, Gray E, Laffan M; British Committee for Standards in Haematology. Guidelines on the laboratory aspects of assays used in haemostasis and thrombosis. Int J Lab Hematol. 2013 Feb;35(1):1-13
2008년 CLSI 지침에 의하면 진공채혈관과 syringe 모두 채혈 가능하다. 바늘의 크기가 21게이지가 좋으면 이보다 적으면 용혈이나 혈소판활성의 문제가 발생할 수 있고, 19게이지보다 크면 혈관손상의 우려가 있어, 21-19 게이지 (소아 23) 바늘로 채혈하도록 한다. 항응고제는 혈장에 가까운 osmolality를 가지면서, 헤마토크릿에 따른 영향을 적게 받는 3.2% sodium citrate를 사용하고 혈액과 항응고제 비율 9:1을 지킨다. 채혈직후 채혈관을 5~6회 아래-위로 부드럽게 혼합한다. 다른 응고검사와 마찬가지로 헤마토크릿이 55% 이상이면 혈장부피가 상대적으로 적어 항응고제의 양을 다음과 같은 공식에 따라 줄여주어야 한다 [(항응고제 부피, ml)=(1.85 x 10-3)x(100-헤마토크릿,%)x(채혈할 혈액 양, ml)].