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유세포분석법을 이용한 Hereditary Spherocytosis 의 진단 부산대병원 진단검사의학과 박상혁 유전구형적혈구증(hereditary spherocytosis, HS)은 말초혈액도말에서의 구형적혈구(spherocyte)의 출현을 특징으로 하는 유전용혈빈혈로 적혈구의 세포막을 구성하는 단백인 spectrin, ankyrin, band 3, protein 4.2 의 양적 또는 기능적 이상에 의해 발생한다. 세포막의 유실이 발생한 적혈구는 골격이 약해지게 되어 비장을 통과할 떄마다 세포막을 구성하는 인지질의 유실이 발생하게 되므로 적혈구 용적은 변화가 없지만 그 세포막의 면적이 감소하게 된다. 결과적으로 표면/용적 비율이 감소하게 되어 결국 구형적혈구로 변화하게 되는 일련의 과정을 거치게 되어 용혈에 취약하게 된다. 그러나 구형적혈구의 출현은 HS에 특이적인 것은 아니며 자가면역용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia, AIHA) 및 다양한 혈색소병증 등에서도 구형적혈구가 나타날 수 있다. HS 의 진단을 위한 검사는 그 원리에 따라 크게 두 종류로 나뉘어진다. 첫번째 방법은 저장성 용액, 글리세롤 및 한랭상태 조성 등 적혈구의 용혈을 유발하는 상황에서 적혈구의 용혈 정도를 평가하는 것으로 용혈 정도는 분광광도계(spectrophotometer)에 의해 측정하게 되며 대표적인 검사로 고전적으로 사용되어 온 삼투압취약성검사(osmotic fragility test, OFT), 산성화글리세롤용혈검사(acidified glycerol lysis test, AGLT) 및 Pink test 등이 있다. 고전적 삼투압취약성검사는 환자와 정상대조 적혈구를 여러 농도의 생리식염수에 혼합한 후 2시간 또는 24시간 배양(incubation)하고 적혈구의 용혈 시작, 50% 용혈 및 전부 용혈되는 생리식염수의 농도를 각각 측정 후 환자의 적혈구가 정상대조에 비해 더 높은 농도에서 용혈이 일어나는지를 확인하게 되며 산성화글리세롤용혈검사 및 Pink test 는 완충 처리된 글리세롤 용액에 환자 및 정상대조 적혈구를 혼합 후 배양시켜 적혈구의 용혈 정도 및 속도를 측정하게 된다. 그러나 고전적 삼투압취약성검사는 검사에 인력 소모가 크고 2시간 배양 시 결과 판정이 어려운 경우가 많아24시간 배양이 필요한 경우가 상당수 발생한다. 그리고 “명백히 증가된 용혈 정도”에 대한 표준 기준이 존재하지 않아 결과 해석이 모호한 경우가 많으며 여러 문헌들에서 HS 진단 민감도가 80% 미만으로 보고되고 있어 비전형적 임상 증상을 보이거나 경도의 빈혈을 보이는 HS 환자의 경우 위음성 결과를 보일 수 있다. 또한 적혈구막 세포골격 구성 구조 성분의 이상에 의한 비면역성 용혈빈혈을 일으키는 질환에는 HS이외에도 HE, 유전성 이형적혈구증가증(hereditary pyropoikilocytosis, HPP) 등이 알려져 있는데 고전적 삼투압취약성검사, AGLT, Pink test 모두 HS 와 HE 및 HPP 을 감별할 수 없으며 자가면역용혈빈혈 등과 같이 구형적혈구가 출현하지만 HS가 아닌 용혈빈혈 환자에서도 위양성을 보이는 것으로 보고된 바 있다. 이를 보완하기 위해 1990년 적혈구의 표면적/용적 비율에 영향을 받지 않는다고 알려진 한랭용혈검사(cryohemolysis test)가 도입되었는데 글리세롤 등을 이용한 고장액에 적혈구를 혼합 후 37°C 에서 0°C 로 급격한 온도변화를 가했을 때 HS 환자의 적혈구가 온도변화에 민감하게 용혈이 발생한다는 점에 기초하여 적혈구의 용혈 정도를 측정하는 검사이다. 이전 연구에서 한랭용혈검사의 HS 진단을 위한 수행능을 평가한 결과 정상인에서의 적혈구 용혈 비율은 평균 7.0% ± 4.4%을 보인 반면 HS환자는 평균 42.0% ± 13.0%으로 유의하게 용혈 비율이 증가하였으며 뚜렷한 임상 증상이 없는 보인자의 경우에도 적혈구 용혈 비율이 36.0% ± 13.0%으로 높았음을 보고한 바 있으며 최근 시행된 HS 진단을 위한 선별검사의 수행능 평가에서도 한랭용혈검사의 HS 진단 민감도/특이도는 78.7%/95.3%, AUC(area under the curve) 0.916으로 고전적 삼투압취약성검사의 HS 진단 민감도/특이도인 73.5%/74.4%, AUC 0.827 에 비해 우수하였음이 보고된 바 있다. 두번째 방법은 SDS-PAGE 법 또는 Band 3 단백 및 Rh단백, Rh연관 당단백, CD47 등과 결합하는 성질이 있는 EMA (eosin-5-maleimide) 를 이용하는 유세포분석에 의한EMA 결합검사(EMA binding test) 등을 통해 적혈구막 구성 단백을 직접 정량 후 결핍된 적혈구막 구성 단백을 확인하는 것이다. SDS-PAGE 법에 의한 적혈구막 세포골격 구조 단백의 직접 검출은 비전형적 임상증상을 보이거나 증상이 경한 HS 환자의 확진에 도움이 되는 검사이지만 시행에 많은 시간이 소요되며 검체의 보관, 단백 추출, 염색, 검사 시행 시의 온도 유지 등에 따라 결과에 많은 영향을 받기 때문에 이러한 요소들을 효과적으로 통제 가능한 제한된 수의 검사실에서만 효과적인 시행이 가능하다는 단점이 있다. 또한 결핍된 적혈구막 세포골격 구조 단백의 종류에 따라 결과 양성율 및 임상 증상의 중등도가 달라 HS 진단 민감도의 유의한 차이가 존재하게 되는데 band 3, spectrin의 결핍이 54%, 31%을 차지하여 HS 의 가장 흔한 원인이지만 11% - 20%의 환자에서 특정 적혈구막 구성 성분의 결핍을 검출할 수 없으며, 결핍된 적혈구막 세포골격 구조 단백 및 임상 증상의 연령에 따른 차이가 존재하여 소아에서는 spectrin 결핍이 가장 흔하고 빈혈, 황달 등의 증상이 더 심한 반면 성인에서는 band 3 결핍이 가장 흔하며 비장비대 및 담낭결석의 빈도는 높지만 임상 증상은 경하다는 것이 보고된 바 있다. 또한 결핍된 적혈구막 세포골격 구조 단백의 종류에 대한 인종적 차이가 존재하여 한국인에서는 서양인과 달리 ankyrin 단독 결핍이 29.6%, protein 4.2 의 결핍이 14.2%에서 나타나 ankyrin 결핍이 가장 흔히 관찰되는 적혈구막 이상이었고 band 3 의 결핍은 11.8%에서만 관찰되었으며 SDS-PAGE법의 위음성율이 33.3% 으로 서양인에 비해 높았음이 보고된 바 있다. 유세포분석에 의한 EMA 결합검사는 적혈구막 세포골격 구조 단백인 band 3단백의 첫번째 세포외측부위(extracellular domain)에 위치하는 430번 아미노산인 lysine에 공유결합을 형성하는 특징을 갖는 EMA 를 이용하여 적혈구막의 형광 정도를 측정하게 된다. EMA는 발현되는 형광의 80% 을 차지하는 band 3 단백 이외에도 Rh 단백 및 Rh 당단백의 30-32 kD 부위, CD47 의 40-60 kD 부위 등과도 결합이 가능하여 유세포분석에 의한 EMA결합검사는 band 3에 국한되지 않는 적혈구막의 전체적인 유지 정도를 평가할 수 있다. 유세포분석에 의한 EMA 결합검사는 5 μL 의 적혈구만으로 시행이 가능하며 검사법이 간단하고 결과 보고 시간이 평균 2시간 정도로 빠르며 수 일간 냉장 보관된 적혈구를 이용하여도 일관성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한 다른 검사들이 분광광도계를 이용하여 용혈 정도를 측정하는 것과 달리 유세포분석기를 이용하기 때문에 각각의 적혈구의 EMA 반응 정도를 직접 측정할 수 있어 HS 진단 민감도 및 특이도가 90% 이상으로 매우 높다는 것이 이전 문헌들에서 보고된 바 있으며 AIHA, HPP 및 포도당-6-인산염 탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)결핍증, 피루브산전환효소(Pyruvate kinase, PK)결핍증과 같은 적혈구막 세포골격 구조 단백의 결핍이 없는 다른 용혈빈혈 질환들에서 위양성을 보이지 않는다는 것이 보고된 바 있다. 그러나 EMA 시약을 -80°C에서 보관할 경우 4개월간은 안정하지만 검사 시 실온에서 오래 방치할 경우EMA 형광 강도가 약화되며 유세포분석 장비를 갖춘 검사실에서만 제한적으로 시행이 가능하다는 단점이 있다. 또한 대부분의 검사실에서는 검사 결과를 MFI(mean fluorescence intensity), MCF (mean channel fluorescence) 등의 환자 적혈구 EMA 형광의 절대값으로 보고하고 있으나 변이계수(coefficient of variation) 와 같은 백분율 형식으로 보고하는 기관도 있어 결과보고 방법이 현재까지 표준화되어 있지 않다. HS 선별검사로 사용될 수 있는 각 검사들의 장단점이 명확히 존재하기 때문에 가장 최근에 발표된 HS 진단을 위한 가이드라인에 따르면 HS가 의심되는 환자가 가족력이 있고, 비장비대 등의 임상 양상과 말초혈액도말 내 구형적혈구의 존재, MCHC 증가, 망상적혈구수 증가 등의 전형적인 검사실 소견을 보인다면 확인을 위한 추가 검사는 필요하지 않지만 말초혈액도말에서 구형적혈구가 소량 관찰되나 다른 검사실적, 임상적, 가족력적인 증거가 없는 경우 HS에 대하여 높은 예측도를 가지는 선별검사가 필요하며, HS 의 진단에 높은 민감도 및 특이도를 보이는 유세포분석에 의한 EMA 결합검사와 한랭용혈검사를 일차 선별검사로 추천하고 있다. 고전적 삼투압취약성검사는 HS 진단 민감도 및 특이도가 낮아 추천되지 않으며, 선별검사의 결과 판정이 애매할 경우 적혈구막 세포골격 구조 단백의 결핍을 확인하기 위한 SDS-PAGE법과 분자유전학적 방법을 통한 유전자 돌연변이 여부의 확인 등이 필요할 수 있으나 모든 환자에 대해서 이들 검사를 시행하는 것은 불필요하다고 명시하고 있다. 최근 기존의 분광광도계를 이용한 고전적 삼투압취약성검사를 대체할 수 있는 검사로 환자의 적혈구를 저장성 용액과 혼합하여 용혈을 유도한 후 유세포분석기를 이용하여 잔여적혈구 백분율을 측정하는 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사가 개발되었다. 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사는 확실한 양성 판정기준이 없는 고전적 삼투압취약성검사에 비해 용혈에 대한 취약성 정도를 정량화하여 구체적인 수치로 제시할 수 있다는 장점이 있으며 최근 HS 환자, 철결핍성빈혈(iron deficiency anemia, IDA) 환자 및 정상인을 대상으로 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사의 HS 진단을 위한 수행능을 평가한 한 연구에서 정상인에서 얻어진 평균 잔여적혈구 백분율인 63.0% ± 20.0%과 비교하였을 때 IDA 환자는 평균 77.0% ± 14.0%의 잔여적혈구 백분율을 보여 유의하게 삼투압취약성이 저하되었으며 HS 환자는 평균 11.0% ± 6.0%의 잔여적혈구 백분율을 보여 유의하게 삼투압취약성이 증가하였고 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사의 HS 진단 민감도 및 특이도가 각각 100.0%, 96.0%으로 우수한 수행능을 보였음을 증명한 바 있다. 다른 한 연구에서도 HS 환자, HE 환자, 지중해빈혈(thalassemia) 환자 및 정상인을 대상으로 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사를 시행하였을 때 HS 및 HE 환자가 평균 9.31% ± 3.75%, 11.37% - 14.10%의 잔여적혈구수 백분율을 보여 정상인의 평균 잔여적혈구수 백분율인 46.26% ± 11.33%에 비해 유의하게 낮았으며 지중해빈혈 환자의 잔여적혈구수 백분율은 76.73% - 90.65%로 정상인에 비해 유의하게 높았고 HS 및 HE 환자의 진단 민감도 및 특이도가 100.0%, 98.0%으로 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사가 HS 및 HE 환자와 다른 원인에 의한 용혈빈혈 환자의 감별진단에 높은 수행능을 보임을 입증한 바 있다. 최근 국내 한 기관에서 EMA 결합검사, 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사, 한랭용혈검사의 HS 진단 수행능을 비교 분석한 바에 의하면, 양성 cutoff 수치는 EMA 결합검사에서 < 86.9%, 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사에서 < 6.6%, 한랭용혈검사에서 > 11.8%으로 설정되었다. EMA 결합검사에서 HS 환자는 AIHA 환자, ACD 환자, IDA 환자에 비해 유의하게 낮은 적혈구막의 EMA 결합 강도를 보였다. 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사에서 HS 환자는 AIHA 환자, ACD 환자, IDA 환자 및 정상 대조군에 비해 유의하게 감소된 잔여적혈구비율을 보였다. 한랭용혈검사에서 HS 환자는 AIHA 환자 및 ACD 환자에 비해 유의하게 증가된 용혈비율을 보였지만 IDA 환자는 HS 환자에 비해서도 유의하게 증가된 용혈비율을 보였다. 다른 원인에 의한 빈혈 환자로부터 HS 환자를 감별하기 위한 세 검사의 민감도/특이도/음성예측도/양성에측도/정확도는 위에서 설정된 양성 cutoff 수치를 적용하였을 때 EMA 결합검사는 97.0%/97.5%/99.2%/91.4%/97.4%, 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사는 93.9%/97.5%/98.3%/91.2%/96.7%, 한랭용혈검사의 경우 48.5%/76.7%/84.4%/36.4%/70.6%이었다. ROC 분석에 의해 설정된 최적의 cutoff 수치가 적용되었을 때 EMA 결합검사(AUC 0.996)와 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사(AUC 0.992)는 우수한 수행능을 보였지만 한랭용혈검사(AUC 0.723)는 EMA 결합검사 및 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사에 비해 유의하게 나쁜 수행능을 보였다. 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사의 우수한 수행능은 정상 대조군이 검사 대상에 포함되었을 때에도 유지되었으나 EMA 결합검사는 정상 대조군이 검사 대상에 포함되었을 때 수행능이 저하되었다. 결론적으로, 검사의 목적이 다른 원인에 의한 빈혈 환자로부터 HS 환자를 감별하는 것일 경우 EMA 결합검사 및 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사가 유의한 차이 없이 우수한 수행능을 보여 추천되며 정상인을 포함한 대조군으로부터 HS 환자를 선별하는 것일 경우는 유세포분석에 의한 삼투압취약성검사가 가장 우수한 수행능을 보여 추천될 것으로 사료된다. 참고문헌
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