유세포분석법을 이용한 발작성야간혈색소뇨증의 진단적 접근

조윤아/송재우(연세의대)

발작성야간혈색소뇨증의 병인

발작성야간혈색소뇨증(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, PNH)은 phosphatidylinositol-glycan complementation class A (PIGA) 유전자 체세포돌연변이에 의한 조혈모세포의 클론성 질환이다. PIGA는 phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A를 발현하는 X-연관 유전자로, 이 전달효소는 다양한 세포 표면 단백의 고정에 필요한 glycophosphatidylinositol (GPI) anchor 형성에 관여한다. PIGA 돌연변이에 의해 glycophosphatidylinositol (GPI) anchor 형성이 안 되면 GPI에 고정된 세포 표면 단백 또한 결핍되는데, 보체활성억제단백인 CD55와 CD59 또한 GPI 고정 단백으로 PNH 조혈모세포 클론 유래 적혈구는 보체 매개 용혈에 민감하게 되어 용혈이 나타내게 된다.

In:Hematology-Basic Principles and Practices. 2005:419-427.

PNH의 흔한 임상양상은 용혈성 빈혈, 정맥혈전 및 혈구 수 감소이다. 정상 조혈모세포 클론이 소멸되지 않으며, PNH 콜론의 비율은 환자마다 다양하고 동일 환자에서도 시기에 따라 다르기 때문에 다양한 임상 양상을 나타낸다. 자연경과는 가벼운 증상에서부터 사망에 이르기까지 다양하다. 달리 설명이 되지 않는 빈혈, 특히 백혈구나 혈소판감소가 동반되고 혈관 내 용혈의 증거가 있는 모든 환자에게서 PNH를 의심해야 한다. 남녀 모두 동등하게 발생하고, 진단 시 평균나이는 40세이다. 진단 당시로부터 중간 생존기간은 10 - 15년 정도 된다. 진단 당시의 심한 세포결핍이나, 골수이형성증후군 또는 백혈병으로의 진행, 높은 연령, 혈소판감소는 나쁜 예후와 관련된다. 반면 PNH 환자의 15% 정도에서 자연회복이 나타난다고 보고되고 있다.

발작성야간혈색소뇨증의 임상 소견

병명과 달리 실제로 검은 콜라색의 발작성 혈색소뇨로를 보이는 경우는 드물기 때문에 임상증상만으로 PNH를 진단하는 것은 매우 어렵다. 빈혈이나 다른 혈구 수 감소를 동반한 복통, 호흡곤란, 혈전증과 같은 증상을 보이는 경우 PNH 선별검사를 실시해야 한다.

1) Clinical indication for PNH testing

위의 표에 열거된 증상들은 임상에서 흔히 관찰 되는 증상들이며 위와 같은 증상들이 있을 때에 모두 PNH 선별검사를 시행하기는 힘들기 때문에 International Clinical Cytometry Society (ICCS) 가이드라인 및 International PNH Interest Group에 의해 정의된 PNH 고위험군을 대상으로 진단검사를 시행한다.

2) ICCS/International PNH Interest Group 고위험군

Blood. 2005;106:3699-3709

3) PNH 환자의 주요 검사 소견

아래와 같은 주요 검사소견을 보일 수 있지만 PNH의 진단과 추적을 위한 표준검사는 유세포분석법을 이용한 GPI anchor 결핍 세포군의 검출 및 정량이다.

유세포 분석법을 사용한 발작성야간혈색소뇨증의 진단

1) 적혈구의 유세포 분석

• 주로 사용되는 적혈구 항원은 CD 55, CD 59
• GPI anchor 결합 단백이 완전히 소실된 세포(type III cell)를 정상 적혈구(type I cell)와 구분하여 정량 하는 것이 목적이며 부분적으로 소실된 세포(type II cell)도 정량이 가능
• 용혈 또는 수혈로 인해 적혈구 분석 결과가 PNH 클론의 크기를 잘 반영하지 않을 수 있기 때문에 백혈구도 함께 분석
• 1%의 민감도로 최소 5,000개의 적혈구를 gating 하여 single-color histogram으로 분석
• Negative control (unstained cells)은 PNH clone의 위치 확인에 사용
• CD55보다 CD59가 선호되는데, CD55는 type II와 type III cell의 구분이 명확하지 않다.
• Glycophorin-A와 CD59를 사용한 2-color assay는 작은 클론의 검출에 유용

2) 백혈구의 유세포 분석

• PNH 클론의 실제 크기를 평가할 수 있는 가장 좋은 방법
• 임파구는 긴 수명과 일정하지 않은 발현 때문에 분석에 적합하지 않으며 주로 과립구와 단핵구가 분석에 사용됨.
• 백혈구 분석 시 음성군과 양성군의 구분이 힘들기 때문에 CD55나 CD59는 잘 사용되지 않는다.
• CD55와 CD59 외에도 과립구에 CD16, CD24, CD66b, 단핵구에 CD14 등이 이용됨.
• Fluorescent aerolysin (FLAER)은 GPI에 직접 결합하기 때문에 GPI 소실과 무관한 GPI anchor 고정 단백의 감소를 감별할 수 있어 백혈구 PNH 클론의 검출/정량에 가장 유용함.
• CD24와 FLAER의 조합을 이용한 multicolor assay

4. 참고문헌

1. Robert A. Brodsky. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 2014;124:2804-11
2. Borowitz et al. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010;78B:211-30
3. Vivek R. Sharma. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: pathogenesis, testing, and diagnosis. Clin Adv Hematol Oncol 2013;11:2-8