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International Council for Standardization in Haematology (ICSH) 권고에 따른 Direct Oral Anticoagulants의 검사 부산의대 김인숙 배경 2008년 oral direct thrombin (factor IIa) inhibitor의 일종인 dabigatran etexilate (Pradaxa, Boehringer Ingelheim)가 대관절 치환수술 후 혈전예방 목적으로 European Medicines Agency (EMA)의 승인을 받은 후, 다양한 direct acting oral anticoagulants (DOACs)가 등장하였다. Direct factor Xa (FXa) inhibitor인 rivaroxaban (Xarelto, Bayer Pharma AG and Janssen Pharmaceuticals), apixaban (Eliquis, Bristol-Meyers Squibb and Pfizer) 과 edoxaban (Savaysa in the United States, Lixiana in Europe, Canada and Japan, Daiichi Sankyo) 등이 승인을 받았다(Table1). Vitamin K antagonists (VKAs)와 달리, DOAC는 통상적인 검사 monitoring이 필요하지 않으나, 응급 상황이나 일부의 비응급상황에서 DOAC 농도 측정이 요구된다. 이에 International Council for Standardization in Haematology (ICSH) 는 DOAC 항응고제 농도를 측정하는 지침을 제공하였다
Table 1. DOAC characteristics
aHalf-life varies with renal function, with increasing half-life with increased renal impairment. Consensus DOAC measurement recommendations: general patient considerations. 비응급검사가 필요하면, 최저약물농도(trough drug level) 검사가 추천된다. (Table 2) DOAC의 농도는 ng/mL units로 보고한다. 보고된 DOAC 결과는 DOAC의 치료농도를 의미하지는 않지만, DOAC으로 치료받은 환자의 예상된 최저 약물농도를 말한다. Table 2. Expected peak and trough DOAC concentrations in patients treated for stroke prevention in NVAF or treatment of PE/VTE
Notes: Other approved indications for DOACs include secondary prevention of PE/VTE, and post hip and knee replacement, which may have alternative dosing strategies. Additionally, changes in doses may occur after initiation phase of DOAC treatment. Consultation of regional DOAC labeling information is required before interpreting or using these peak and trough DOAC concentration data. aMean (25th–75th percentile). bMean (5th–95th percentile). cMedian (5th–95th percentile). dMedian (1.5 x interquartile range). eMedian (interquartile range). DOAC의 검사실 측정 DOAC 측정의 최적의 검사실적 방법은 유무를 확인하는 정성검사와 농도를 측정하는 정량검사(ng/mL)의 목적 및 요구되는 turn-around-time (TAT)에 따라 결정된다. 자동화 응고장비가 DOACs의 선별 및 정량이 가능하지만, 생명을 위협하는 출혈이나, 급성뇌경색의 치료를 위해 즉각적인 결과가 필요한 경우에는 검증된 point-of-care testing (POCT) 를 고려할 수 있다. Consensus DOAC measurement recommendations: general laboratory considerations.
DOAC 측정의 검체 준비 Consensus sample recommendations for DOAC assessment
DOAC의 정성 측정법 Direct anti-FIIa 또는 anti-FXa activity 때문에, DOACs은 대부부의 clot-based haemostasis tests에 간섭을 보인다. 상업화된 calibrator와 정도관리 물질을 이용한 PT 및 activated partial thromboplastin time (APTT) 시약은 DOAC 존재를 측정하기 위한 clot-based screening assays로는 민감도가 낮아 권고되지 않는다. 정상 PT 및/또는 정상 APTT를 보이는 경우, DOAC 존재가 없음으로 판단한다면, 위음성 결과가 초래될 수 있다. 뿐 아니라, 환자의 내인적인 응고억제인자나 응고인자부족에 의해 PT 및 APTT가 연장되므로 DOAC의 항응고력을 측정하기에는 특이도가 낮다. DOAC를 치료받는 환자들에서 unfractionated heparin (UFH) 또는 low-molecular-weight heparin를 선행하여 사용한 환자들이 있어 검사의 특이도는 역시 낮다. 신기능에 따라, 결과가 달라 질 수 있다 (Table 3). Table 3. DOAC interference on coagulation assay bConcentration dependent. cApixaban usually not affecting result. dFor fibrinogen—if measured using the Clauss method, most reagents will not be affected. For PT-derived measurements, results are more likely to be factitiously increased. 1) Prothrombin Time Dabigatran 및 rivaroxaban은 약물 농도에 비례하여 PT가 연장된다. Dabigatran은 rivaroxaban보다 PT 결과에 덜 민감하다. International normalized ratio (INR) 과 international sensitivity index (ISI)는 VKA에 민감도를 나타내므로, DOACs를 사용하는 환자들은 INR로 표현하지 않는다. 비록 rivaroxaban에 대한 ISI를 만들어 PT를 표준화하기 위한 노력이 있으나, 널리 이용되지 않는다. 왜냐하면, 이러한 시도가 apixaban이나 edoxaban 측정에는 적용되지 않기 때문이다 . 2) Activated Partial Thromboplastin Time APTT는 dabigatran 및 rivaroxaban의 약물농도에 비직선적으로 연장된다. Rivaroxaban이 dabigatran보다 덜 민감하다. 상업화된 APTT 시약에 따라 검사의 민감도가 다르다. Normal PT 와 APTT 결과는 dabigatran 50 ng/mL이상 농도의 dabigatran의 존재는 제외할 수 있으나, 50 ng/mL 농도의 rivaroxaban의 존재나 200 ng/mL 농도의 apixaban의 존재의 검출은 할 수 없다. PT 및 APTT의 낮은 민감도와 특이도로 이러한 검사는 DOAC 농도를 측정하기는 어렵고 시약에 따라 다른 결과를 보인다. 3) Other Screening Assays TT는 dabigatran에 상당히 민감하나, direct anti-Xa inhibitor에는 해당되지 않는다. 30 ng/mL 미만의 dabigatran 농도에서 TT의 연장이 확인된다. 정상 TT는 dabigatran이 없거나 미량이 있음을 시사한다. 4) Point-of-Care Tests Tromboelastograph (TEG)의 R time의 연장이나 rotational thromboelastogram (ROTEM)의 clot formation times (CFT)의 연장은 dabigatran 및 rivaroxaban 농도에 관련된다. Ecarin-base ROTEM이 최근에 낮은 농도의 dabigatran에 민감하다고 보고되었다. TEG나 ROTEM과 같은 viscoelastic measurements는 peak samples (최고농도 검체)에는 민감하나, trough samples(최저농도 검체)에서는 민감도가 떨어진다. PT, APTT 및 activated clotting time [ACT] 등의 POCT법은 불량한 상관성을 보이며 나쁜 민감도를 보여주었다. 소변검체를 통한 DOAC screening assay가 평가되었는데, 소변과 혈장의 DOAC 농도와의 상관관계는 확인되지 않았다. 최근 renal function (creatinine), anti-Xa 및 direct thrombin inhibitor를 동시에 screen가능한 상업화된 소변 POCT kit가 유럽에서 소개되었다 Consensus screening test recommendations: PT 및/또는 APTT는 모든 종류의 DOACs의 치료 농도로 존재시는 검출을 믿을 수 없을 수 있다. 특히, 치료 농도의 apixaban 농도에서는 PT 및 aPTT가 반응하지 않는다. PT 및 APTT는 DOAC 농도를 측정하는 검사로 이용해서는 안된다. DOAC 의 정량 측정법 DOAC 농도를 가장 정확하게 측정할 수 있는 방법은 LC-MS/MS 나 drug-calibrated clot-based 또는 chromogenic method이다. 그러나, LC-MS/MS 법은 적용가능성 및 복합성 때문에 제한되어 사용되고 있다. 그래서, drug-calibrated clot-based 또는 chromogenic methods가 자동응고장비에 적용되어 사용되고 있다. 1) Mass Spectrometry Measurement of DOACs LC-MS/MS는 검사의 높은 특이도, 민감도, 및 재현성으로 인해, DOACs 농도 측정의 gold standard로 여겨진다. LC-MS/MS를 이용한 DOACs 정량 측정은 lower limit of detection (LLOD, 하한 검출범위) 과 lower limit of quantitation (LLOQ, 하한정량범위)이 약 0.025 ng/mL 과 3 ng/mL으로 보고된다. 보고가능범위는 5~500 ng/mL로 보고되고 있어, 최고 및 최저 농도를 보이는 모든 환자에게 적용이 가능하다 (Table 2). 검사내 정밀도(Intra- assay precisions)와 검사간 정밀도(inter-assay precisions)은 약 6% 및 10% 미만으로 보고되고 있다. 임상검사실에서 mass spectrometry의 이용은 노동집약적 검체 준비, 검사의 복잡성, 기기의 이용가능성으로 제한되어 있다. 뿐 아니라, 검사 자체의 matrix effect, co-elution of other compounds (drugs or xenobiotics), internal standard 준비, 및 부절적한 검출 또는 약물대사체 측정 불능 등의 문제가 야기될 수 있다. 이 검사들은 대부분 ‘in-house’ 또는 자체개발검사 (laboratory-developed tests (LDTs))로 검사의 검증이 필수적이다 LC-MS/M의 주요 제한점은 표준화의 부재와 공용화된 calibration material 또는 국제 참고 기준이 없음이다. 상업적으로 이용가능한 질높은 참고물질 및 국제 기준이 급히 요구되는 실정이다. Consensus LC-MS/MS recommendations:
2) Other Methods for Quantifying Anti-FIIa (Dabigatran) DOAC DTIs (direct thrombin inhibitors)를 측정하는 방법은 ecarin clotting time (ECT), chromogenic ecarin assay (ECA), chromogenic anti-FIIa (C-FIIa) assay, dTT ( dilute thrombin time), dilute Russell's viper venom time (dRVVT) 등이 포함된다. 이러한 검사는 calibration를 적절히 시행하면 dabigatran 정량에 사용될 수 있다. Ecarin-Based Methods Ecarin은 일종의 metalloprotease로 prothrombin을 meizothrombin으로 전환시키며, heparin이 아니라, direct thrombin inhibitors (DTIs)에 의해 억제된다. Ecarin-Based Methods는 clot-based (ECT) 및 chromogenic assay (ECA)가 있다. ECT 시약은 ecarin (5 units/mL), buffer와 CaCl2으로 구성되어 있으며, 검사에 시약과 환자 혈장을 동량을 넣어서 검사한다. 고농도의 약물 농도일 때는 환자 혈장을 normal pooled plasma (NPP)와 1:1로 섞어서 검사한다. 보고된 imprecision은 5%미만이다. Fibrinogen 및 prothrombin (factor II) 결핍이 검사의 정확성에 영향을 미친다. LC-MS/MS 측정과 좋은 직선 상관관계를 보여준다. Chromogenic Anti-FIIa Assay Chromogenic anti-FIIa assay (C-FIIa)를 통한 dabigatran 농도측정을 위한 상업화된 kit 들이 존재한다. ECA와 유사하게 thrombin을 위한 기질이 환자의 혈장 검체에 더해져서 2분간 incubation 후에 thrombin 시약을 넣은 후에 반응이 멈추면 결과를 판독한다. 검사 시약에는 heparin neutralizing agent가 포함되어 있어, heparin을 선행하여 사용한 환자에게서도 적용가능하다. C-FIIa 역시 LC-MS/MS와 좋은 상관관계를 나타낸다. Dilute Thrombin Time 상업화된 상품이 존재하며, 환자 검체와 NPP가 대략 1:8로 희석되어 검사된다. Dabigatran를 사용하는 환자에서 dTT와 LC-MS/MS의좋은 상관관계가 확인되었다. Consensus anti-FIIa (dabigatran) DOAC test recommendations: Drug-calibrated DTT, ECA, ECT 및 anti-FIIa chromogenic methods는 LC-MS/MS와 좋은 상관관계를 보이며, dabigatran의 신속한 정량 측정에 적합한 검사법이다. 3) Methods for Quantifying Anti-Xa DOACs Chromogenic Anti-Xa Assay Chromogenic anti-Xa assay (C-FXa) heparin의 항응고능을 확인하기 위해 수십년간 검사되어 왔다. Rivaroxaban의 경우, 실험실 환경에서 30 ng/mL 미만의 농도에서 충분히 측정되지 않았다. 이에 반해 apixaban 및 edoxaban은 낮은 농도도 측정되었다. Rivaroxaban 측정의 민감도를 향상시키기 위한 검사 (i.e. the Biophen Direct Factor Xa Inhibitors LOW, Hyphen BioMed, France) 는 낮은 농도를 측정가능하나, 측정가능범위의 하향을 보였다. C-FXa kits에서 Antithrombin supplementation 은 direct FXa inhibitors를 overestimation하므로 피해야 한다. Heparin standards로 calibration되는 C-FXa assay는 direct FXa inhibitors의 존재는 확인할 수 있지만, 직선성과 정량에 있어 제한점이 있다. Chromogenic substrates, factor FXa origin, 검사법, 및 heparin calibration 등의 요인에 의해, heparin-calibrated C-FXa 검사는 주의하여야 한다. 모든 종류의 heparin-calibrated methods는 direct FXa level과 유사한 민감도를 가지지는 않는다. Consensus anti-FXa DOAC test recommendations: Drug-calibrated anti-FXa 검사는 LC-MS/MS와 좋은 상관관계를 보이므로 anti-Xa DOACs의 신속한정량 검사로 추천된다. Antithrombin supplement anti-FXa 검사는 DOAC 농도를 과다하게 측정하므로 이용해서는 안된다 검사법의 Validation 및 성능 Verification 검사의 Validation(검증)은 accuracy (or trueness), precision (repeatability and intermediate [inter-assay] precision), specificity (selectivity), LLOD (DOAC level that is significantly different than zero), LLOQ (lowest DOAC measurement that meets acceptable performance criteria), linearity, range (reportable range) 및 stability를 포함한다. 검사 성능의 Verification(확인)은 precision, accuracy 및 linearity 등이 포함된다. Accuracy는 precision, linearity 및 specificity가 확인되면 생략할 수 있다. Validation Samples 다양한 물질, ex vivo drug-spiked plasma, 정도관리물질 또는 calibrators를 이용할 수 있다. Chromogenic 또는 clot-based 정량 DOAC 검사에서 가장 먼저 수행해야 하는 과정은 calibration 이며, 허용가능한 calibration curve에 대한 기준 확립이다. Calibration curve는 예상가능한 DOAC 농도를 포함하여야 하고, 거의 LLOQ에 가까운 농도의 calibrator가 필요하다. Calibration curve의 검증은 정의된 DOAC 농도의 한계까지 검체가 측정되어야 한다. Calibration curve가 허용가능하다면, within-run precision (repeatability)이 평가되어야 한다. Intra-assay precision를 평가하기 위해서는 측정가능범위를 포함하는 최소 9번의 측정 (예: 3가지 농도의 세번 반복 측정)을 하거나, 한가지 농도를 최소 6번 측정하는 것이 필요하다. Between-run precision를 위해서는 LLOQ, 낮은 물질, 중간물질, 고농도 물질의 검체가 이틀 이상동안 최소 3번의 검사가 필요하다. CV의 한계는 LLOQ는 20% 미만이고, 그외는 15%미만이다. Linearity는 보고가능범위 이상의 최소 5~6개의 검체를 통해 결정된다. LLOQ 및 LLOD의 반복측정을 통한 결정은 6~10개의 검체를 통해 산출한다. Accuracy (trueness)는 참값에 측정한 값의 근접도에 해당한다. Calibration curve의 하한 1/3 및 상한 1/3를 포함한 최소 3단계의 검증용 물질로 측정한다. 검증용 물질이 표준곡선을 벗어난 값을 가지면 안된다. Accuracy의 허용기준은 다양하나, 측정값과의 차이가 15%이내이고, LLOQ에 대해서는 20%이내이고, 편차결정이나 paired t-test 등의 통계학적 분석이 기술되어야 한다. Stability는 냉동 해동 과정을 −80°C, −20°C, 실온을 포함하여 검사할 수 있다. 시약 및 검체의 carryover는 precision과정동안 평가할 수 있다. Robustness는 검증과정 중에서 시약, 상업화된 calibrator 및 정도관리물질의 한가지 이상의 lot에서 평가할 수 있다. Consensus recommendations for method validation or verification of performance: 검사 성능의 validation 및 verification는 임상보고를 하기 전에 시행해야 한다. 검사법의 validation 또는 verification를 하기 전에, 시행방법 및 허용기준이 기술된 protocol 기록되어져야 한다. 검사법의 validation에는 precision, accuracy, linearity, determination of LLOQ, LLOD, 및 보고범위가 포함되어야 하고, stability도 포함될 수 있다. 검사법의 verification에는 precision, accuracy 및 linearity가 포함되어야 한다. DOAC External Quality Assessment/Assurance 검사의 질을 보장하기 위해서는 내부정도관리 및 외부정도관리가 필요하다. 내부정도관리는 매일또는 검사가 시행되는 날에 시행되어야 한다. 외부정도관리는 Table 4와 같은 프로그램이 있으며, 현재 가능한 항목들이 기술되어 있다. Table 4 External quality assurance programs for DOAC 요약 PT 및 APTT는 DOAC 농도 측정에 신뢰있는 검사가 아니다. dTT, ECA, 및 ECT는 dabigatran 농도와 직선적 연관성을 보인다. Drug-calibrated anti-Xa 검사는 anti-Xa DOACs 농도의 표준검사인 tandem mass spectrometry 측정에 비견할만 하다. DOAC 검사의 검사전 단계는 검체의 채취 및 검체의 안정성에 대한 지침을 제공한다. DOAC 검사의 검사단계에서는 검사법의 validation 및 성능 verification에 대해 제시한다. DOAC 농도측정의 gold standard는 tandem mass spectrometry이나, drug-calibrated dTT, ECA, ECT, anti-FIIa 및 anti-FXa 역시 DOAC농도의 신속검사가 가능하다. DOAC 검사의 검사 후 단계에서 보고는 ng/mL로 보고하고, 지속적인 질관리를 위해 외부정도관리에 참여하여야 한다. 참고문헌
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Abbreviation: Tmax, time to peak drug concentration after dose.
Abbreviations: bid, twice daily; IQR, interquartile range; NVAF, non-valvular atrial fibrillation; PE, pulmonary embolism; qd, once daily; VTE, venous thromboembolism.
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